Basic Cell Work Protocol

Protocol

 

Ⅰ. Cell work Media 만들기

*Materials: DMEM 500ml x2, Anti-biotics, 10X FBS

1. DMEM 10ml 빼서 버리기

2. A-A 10ml 넣어주기

3. FBS 100ml 추가한 후 filtering*

*media 부어서 새지 않는 것 확인한 뒤 suction기 틀어주기

 

 

Ⅱ. Cell thawing

1. 질소탱크에서 Cell stock 꺼낸 뒤 37℃ water bath에서 녹여주기

2. 15ml tube에 차가운 media 9ml 넣어주기

3. Cell stock vial에서 1ml 딴 뒤 15ml tube에 넣어주기

*딸 때 약하게 pipetting, 15ml tube에 넣어줄 때도 마찬가지

4. Centrifuge for 5 min, 1500 rpm, RT

5. Cell culture dish 준비

  1) Dish labelling

  2) Media 9ml 넣어주기

  3) Media 1~3ml 정도 15ml tube에 소분해두기

6. Centrifuge 다 된 tube에서 supernatant suction

7. 소분해 둔 media에서 1ml 딴 뒤 cell pellet resuspension

8. Media 담아두었던 cell culture dish에 resuspension 끝난 세포 잘 퍼지도록 뿌려주기

9. 현미경으로 density, 뭉침 여부 확인하기

*다음날 media change

 

 

Ⅲ. Media change

1. Media suction

2. PBS wash (35 øø 2ml / 60 ø 4ml / 100 øø 6ml / 150 øø 9ml)

3. PBS suction

*debris, dead cell 정도에 따라 PBS wash 한번 더 추가

4. 37℃ water bath에 데워 둔 media 10ml 넣어주기

 

 

Ⅳ. Cell subculture

1. Media suction

2. PBS wash

3. Tripsin-EDTA 1ml 뿌려준 뒤 골고루 퍼트려주기

4. 5 min incubation in an incubator

5. Cell 모두 떨어지면 media 9ml 넣고 harvest, 15ml tube에 옮겨주기

6. Centrifuge for 5 min, 1500 rpm, RT

7. Supernatant suction

8. Pellet 양에 따라 media 넣어준 뒤 resuspension

9. Cell culture dish에 seeding