Midi-prep Protocol

Protocol

 

* Materials

 

- Midi-prep Kit: MN midi-prep kit

- 세포 배양 적당량: 100~200ml

- LB broth

  1) Dissolve LB-Broth (25g/L) in DW and autoclave

  2) Leave the solution at RT to cool down

  3) Add Ampicillin at a concentration of 100ug/ml just before using

 

 

* Methods

 

 

Ⅰ. Midi-culture

 

1. Transformation이 완료된 LB plate에서 colony harvest, 100ml LB broth에 넣어주기

 

2. 37℃ Incubator에서 O/N culture, shaking

 

 

Ⅱ. Midi-prep

 

1. Centrifuge cultured media, 6000 rpm, 10 min, 4℃

 

2. Supernatant (= LB media) 버리기

 

3. 3가지 buffer 1:1:1 비율로 차례대로 넣어주기

  1) Res (resuspension buffer) 6ml 넣고 pellet 전부 풀릴 때 까지 vortexing

  2) LYS (lysis buffer) 6ml 넣고 inverting (vortexing 금지)

  3) NEU (neutralization buffer) 6ml 넣고 inverting (vortexing 금지)

 

4. Centrifuge 6000 rpm, 10 min, 4℃

 

5. Pellet Wash, Elution

* Centrifuge 돌아가는 동안 EQU 8ml씩 부어서 Column membrane equilibration(activation)

  1) 50ml tube에 Cell strainer로 걸러준 뒤 column에 loading

  2) EQU (washing buffer) 20ml씩 부어서 washing

  * washing 완료되면 column을 50ml tube로 옮겨주기

  3) ELU (elusion buffer) 5ml씩 column 벽면에 흘려주기

 

6. 획득한 용액에 Isopropanol 3.5ml씩 넣어주고 용액이 고르게 탁해질 때까지 inverting

 

7. Centrifuge 12000 rpm, 15 min, 4℃

 

8. Supernatant 버리기

 

9. 75% EtOH 1ml 넣은 뒤 pellet 녹을 때까지 vortexing

* 1.5ml tube로 용액 옮겨주기

 

10. Centrifuge, 12400 rpm, 1~2 min, 4℃

 

11. Supernatant 버리기

 

12. RNase-free DW 넣어 pellet (=DNA) 녹여주기

 

13. Nanodrop으로 purity check